平台介绍

• CRISPR-Cas9即成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes，Cas gene），是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”；
•  CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，目前已发现三种不同类型的CRISPR-Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中；
•  Cas9蛋白可有效地对gRNA介导的特定位点进行编辑，将外源基因整合到自身基因中，具有核酸内切酶的作用。现广泛应用于基因工程中。

服务内容

• 基因定点突变细胞系
• 单基因敲除/敲入细胞系
• 多基因敲除/敲入细胞系
• CRISPR/Cas9 (genes, LncRNA, CircRNA)：sgRNA效率验证 CRISPR/dCas9：sgRNA效率验证）

实验方法

• 本公司采用双病毒（慢病毒+腺病毒）系统进行基因敲除细胞株构建，慢病毒：只携带单靶向点sgRNA或多靶点sgRNA的慢病毒；腺病毒：只携带Cas9基因的腺病毒。
• 首先用慢病毒感染靶细胞构建稳定表达sgRNA的细胞株，再用腺病毒浸染稳定表达sgRNA的细胞株并进行靶基因表达验证，最后进行单克隆筛选获得敲除目的基因的稳定细胞系。

实验优势

1. 目前其它商业平台基本采用单独慢病毒系统（sgRNA+Cas9在同一个慢病毒中），导致基因阅读框大，出毒率低，敲除效率低导致单克隆筛选困难，实验周期约3个月以上，重要的是因慢病毒会整合靶细胞基因组，Cas9蛋白会持续表达在靶细胞中，但由于Cas9蛋白具有显著的免疫原性^[1]，体外非免疫学研究可采用该系统，体外免疫学研究及体内研究采用该方法结果容易被审稿人质疑。
2. 本公司建立的双病毒（慢病毒+腺病毒）系统可有效避免上述问题，单表达sgRNA的慢病毒基因阅读框小，出毒率高，在建立稳转株后用表达Cas9蛋白的腺病毒浸染（腺病毒优势：腺病毒表达基因不会重组在靶细胞基因组中，浸染后1周内高表达目的蛋白，1周后腺病毒及靶蛋白降解，因此无免疫原性，且腺病毒表达量>>慢病毒），流式在单细胞水平上验证靶蛋白敲除效率，随后进行单克隆挑选并验证，整体实验周期约1-2个月（具体以靶基因的功能及细胞株生长状态决定）。

案例展示

• sgRNA稳转细胞株构建完成，腺病毒感染6天靶基因沉默效率约70%（图A）,从11个单克隆细胞株中筛选3个可能敲除100%的单克隆（图B），经扩大培养后单细胞流式验证成功构建3株靶基因沉默细胞株（图C）。该实验整个周期1个月。

结果提供

1. 敲除细胞株至少1株
2. 靶基因表达流式验证结果图或WB验证结果图
3. Cas9蛋白表达验证WB图
4. 实验过程原始数据
5. 其余需要附加结果另外协商

参考文献

[1] J. Dubrot, S.K. Lane-Reticker, E.A. Kessler, A. Ayer, G. Mishra, C.H. Wolfe, M.D. Zimmer, P.P. Du, A. Mahapatra, K.M. Ockerman, T.G.R. Davis, I.C. Kohnle, H.W. Pope, P.M. Allen, K.E. Olander, A. Iracheta-Vellve, J.G. Doench, W.N. Haining, K.B. Yates, R.T. Manguso, In vivo screens using a selective CRISPR antigen removal lentiviral vector system reveal immune dependencies in renal cell carcinoma, Immunity 54(3) (2021) 571-585.e6.