染色原理

• 免疫组织化学(immunohistochemistry)：是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究技术。 

染色步骤

石蜡切片组织包埋和切片

1. 取新鲜组织厚度不超过5mm，置于4%多聚甲醛或者10%的中性福尔马林固定大于48h后，取出置于包埋盒中，并用铅笔做好标记；
2. 固定后自来水冲洗1-2h；
3. 脱水透明 二甲苯(10min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min)→95%乙醇(5min)→90%(5min)→85%乙醇(5min) →80%乙醇(5min) →75%乙醇(1h) →85%乙醇(1h) →90%(3次，共1h) →95%乙醇(3次，共1h) →无水乙醇(3次，共1h) →二甲苯（2次，共1h）；
4. 石蜡浸泡，3次，共2h，最后将包埋盒置于新蜡中用包埋机包埋；
5. 包埋结束后，待蜡块冷却后，将蜡块置于冰上，于切片机上切片，切片厚度一般为4-5um。漂片温度为42℃，摊片温度为65℃左右，待切片上多余的石蜡烤干后，将切片置于切片盒中室温保存。

石蜡切片免疫组化染色

1. 石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤2-3h，防止脱片；
2. 脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min)→95%乙醇(5min)→90%(5min)→85%乙醇(5min)  →75%乙醇(5min)；
3. 蒸馏水冲洗2次5min；
4. 过氧化氢封闭（去除内源性过氧化氢酶），3%H₂O₂去离子水孵育20min(室盒避光)，，流水冲洗2min，以清除内源性过氧化物酶活性；
5. PBS洗5分钟/次，3次；
6. 添加血清封闭封闭非特异性结合位点，使用二抗来源的山羊血清，37℃封闭30min；，甩去液体，不洗；
7. 滴加一抗，4℃过夜或37℃孵育2~3h；37℃复温30min，（效应越低，时间越久）；
8. PBS冲洗3次各5min；
9. 滴加二抗（生物素标记的山羊抗兔/鼠工作液），37℃孵育30min；
10. PBS洗3次各5min；
11. 添加SABC工作液37℃孵育30分钟，PBS洗3次各5min；
12. DAB工作液室温显色，自来水充分冲洗（在显微镜下控制染色时间，大概10分钟）；
13. 苏木素复染细胞核3min，自来水充分冲洗；
14. 脱水、透明，步骤2反向进行；
15. 封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

染色结果

• DAB显色阳性应为棕黄色、棕色或棕褐色，而黄色的浅淡背景不应视为阳性。
  

案例展示