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细胞增殖/毒性实验--MTT

来源：细胞生物学研究平台

细胞增殖/毒性实验--MTT

细胞增殖毒性实验广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖实验、细胞毒性实验以及药敏实验等。

实验原理

MTT化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴蓝，是一种黄色的染料，被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测；
其检测的原理为MTT可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原生成结晶状的为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒；
然后通过酶联免疫检测测定570nm波长处的吸收波，可间接反应活细胞的数量。细胞增殖越多越快，吸光度越高；毒性越大，则吸光度越低。

实验流程

实验步骤

收集传代培养的处于对数生长期的细胞，加入培养基制成细胞悬液；以每孔0.8-2×10³的细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100µL细胞悬液，每组3-5个复孔，将96孔板置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养24h后加药（注意：细胞数量和时间根据实验条件摸索）；
加入100µL含不同浓度的药物培养适当的时间，并设置空白对照；
每孔分别加入20µL 5mg/mL的MTT溶液，于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中继续培养2-4小时；
待甲瓒形成后，终止培养，弃去上清液，每孔加入150µL DMSO，摇床轻微振摇5-10min，蓝色的甲瓒结晶物充分溶解，形成颜色均一的溶液；
酶标仪（570nm）测定每孔的吸光度值（OD）值，记录结果并计算其平均值（实验中控制每孔的吸光度值在0.8-1.2之间）。

数据处理

相对细胞增殖抑制率(%)=(平均对照组OD₅₇₀－平均实验组OD₅₇₀)／平均对照组OD×100% 。获得数据后，使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，计算出抑制率变化曲线与IC_50，其中每个细胞的增值抑制实验至少重复3次。

案例展示