实验原理

• Western blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质；
• 经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体上（例如PVDF膜），固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；
• 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

 实验步骤

1. 提取蛋白并定量：此处操作均需在冰上进行，去除上清液，用冷PBS洗2次，0.25%的胰酶消化后转移至EP管中离心，再用冷PBS洗2次后加入100～300 µL含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解30min，每10min吹打一次。离心，取蛋白上清;
2. 用BCA蛋白浓度测定法对样品定量算出浓度后，将所有蛋白样品调至统一浓度，加5×蛋白上样缓冲液，水浴煮沸5min，将蛋白样品溶液分装置于-20℃冰箱中冷冻保存;
3. 配制SDS-PAGE凝胶，配制SDS-PAGE凝胶,每孔蛋白上样量20 μL，1×Runingbuffer电泳。80V，2h电泳把不同分子量的蛋白分开，电泳结束后，取出凝胶;
4. 剪取合适大小的PVDF膜并在甲醇中浸泡10s后，按板(黑色)，纤维棉，三层滤纸，凝胶，PVDF膜，三层滤纸，纤维膜, 板(红色)的顺序叠放，充分排除各层间的气泡，100 V，1h转膜;
5. 置于水平摇床上含5%脱脂奶粉的TBS/T封闭液中封闭1-2h。封闭完后TBS/T洗膜3次，每次5min;
6. 一抗4℃摇床摇动过夜孵育。取出膜，置于摇床上TBS/T的溶液中洗膜3次，每次10min。
7. 二抗37℃孵育1h。孵育时间到后取出膜，置于摇床上TBS/T的溶液中洗膜3次，每次45min;
8. 曝光显影试剂盒A液和B液以1:1混合均匀后，曝光显影混合物涂抹在PVDF膜上，曝光显影仪上自动曝光。

 案例展示