实验原理

         IP-蛋白富集，Co-IP-蛋白互作

• 免疫共沉淀（Immunoprecipitation/Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法；
• 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。

优点

• 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
• 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
• 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点

• 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
• 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
• 必须在实验前通过工具或网站预测存在相互作用的可能性，再通过IP实验进行验证。

实验步骤

1. 收集细胞，吸除培养基，用预冷的PBS洗涤细胞；
2. 吸除PBS，在10cm的细胞培养皿中加入细胞裂解液（需添加蛋白酶抑制剂），置于冰上裂解；
3. 从板上刮下细胞，把细胞裂解液转移至微量离心管中，置于冰上；
4. 超声破碎细胞，根据不同仪器和型号确定功率和超声时间；
5.  4℃离心，小心吸取上清液至新的离心管中；
6. 取细胞裂解液至新的离心管中，加loading buffer在98℃条件下变性5min，作为input组；
7. 在正式加入目的蛋白抗体进行IP前，取细胞裂解液，与目的蛋白抗体同一种属来源的正常同型lgG及Protein A/G琼脂糖珠进行非特异性吸附，4℃孵育；
8. 使用非偶联的一抗时，将一抗（按照抗体说明书上建议的合适的稀释比例）添加到细胞裂解液中，置于摇床上4℃过夜孵育，
9. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
10. 总蛋白中加入 Protein A/G琼脂糖珠（50%），轻轻摇动，并在4℃下孵育1-3小时。以去除非特异性杂蛋白，降低背景；
11.  4℃离心，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子，用细胞裂解液，洗涤沉淀，洗涤期间，保持样品于冰上，
12. 使用WesternBlot检测进行分析； 

案例展示