实验原理

• 双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase Reporter Assay System）包括两个报告基因，一个检测用报告基因 A 与一个内参用报告基因 B。一般是将检测用报告基因 A 序列与调控启动子序列偶连在一起，或将报告基因 A 序列与待检序列串联，报告基因 A 荧光强度的相对改变与偶联的调控启动子的活性或待检序列的改变相关；
• 内参用报告基因 B 与一个组成型启动子偶联，这个启动子不受各种实验条件变化的干扰，所以报告基因 B 的荧光为组成型表达，可以作为内参；
• 检测用报告基因 A、内参用报告基因 B 可以装在不同的载体上，共同转染细胞，通过这种方法，把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小。有的载体上同时含有检测用报告基因 A 和内参用报告基因 B，这样使实验操作更加准确、简便、快捷。

常用载体

1. pGL3 Luciferase Reporter Vectors （pGL3-Control Vector、pGL3-Basic Vector、pGL3-Promoter Vector、pGL3-Enhancer Vector）；
2. psiCHECKTM Vector（psiCHECKTM-1 Vector、psiCHECKTM-2 Vector*）；
3. pmirGLO Vector。
4. 内参用报告基因（组成型表达海肾荧光素酶）：
5. pRL-TK；pRL-SV40；pRL-CMV；pRL-Null。

注：psiCHECKTM-2 Vector、pmirGLO Vector 同时表达萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）及海肾荧光素酶（Renilla Luciferase），故无需准备对照 pRL 系列内参质粒，可直接进行下游双荧光素酶检测实验。

应用范围

不同载体用途不同

1. pGL3-Basic Vector 可以用来检测潜在调控哺乳动物基因表达的因子，包括顺式作用元件如启动子和增强子以及反式作用因子如大量的 DNA 结合因子。
2. psiCHECKTM-2 Vector 可以用来检测合成的短双链干扰 RNA（包括 siRNA 及 microRNA）的干扰效果，是一个初期筛选的平台，但因其启动子为强启动子，所以更适合筛选 siRNA 有效干扰序列。
3. pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector 可 以 用 来 判 断 microRNA（miRNA）潜在的结合位点，是一个初期的筛选平台，为进一步靶点的鉴定提供依据。

实验步骤

1. 报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。
2. 转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1-50:1。
3. Luciferase活性测定：
4. 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。
5. 加入1×PLB，室温裂解细胞15 min，把裂解液转移到检测试板中。每孔100μl，实验设计3复孔；
6. 配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。
7. 加入LARII试剂，酶标仪上检测萤火虫荧光素酶活性；
8. 取出测试板，加入Stop&Glo^®试剂，酶标仪上检测海肾荧光素酶活性；（为避免荧光淬灭影响实验结果，3.4-3.5步骤需要逐孔依次测定）

案例展示