实验原理

• 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸 (PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。
• PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白对PS具有高度亲和性，可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
• PI染料是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，不能对活细胞染色，但对丧失细胞膜完整性的晚期凋亡细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染成红色。
• 将Annexin V和PI联合使用，可以将不同凋亡时期的细胞区分开来。

实验步骤

1. 收集传代培养的处于对数生长期的细胞，以2×10⁴cells/well的细胞密度接种于6孔板中，24h后，以不同浓度的药物处理，同时设置空白对照组（注意：细胞数量和时间根据实验条件摸索）；
2. 继续将6孔板置于37℃，5%CO₂细胞孵箱中培养，加入胰酶消化（悬浮细胞不需要胰酶消化），收集细胞于按浓度依次编号的流式管中，冷PBS洗两次，加入500 µL binding buffer后，各加5µL Annexin V和PI，室温避光染色15min，上流式细胞仪检测。

案例展示

四个象限的意义：

Q1：坏死细胞

Q2: 晚期凋亡细胞

Q3：早期凋亡细胞

Q4:  活细胞

细胞凋亡率：Q2: 晚期凋亡细胞和Q3：早期凋亡细胞象限百分率的和